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        ELISA實驗步驟及注意事項

        發布時間: 2023-07-11  點擊次數: 121次

        ELISA實驗步驟及注意事項:

        1、固相載體選擇

        聚苯乙烯:具有較強的吸附蛋白質的性能,抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。

        聚氯乙烯:聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高溫物。

        良好的ELISA板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。

        2、包被

        ①板孔的選擇:ELISA配套的微孔板。

        ②抗體選擇:何針選擇支持ELISA實驗的抗體,根據推薦濃度稀釋或摸索最適濃度。

        ③包被緩沖液:pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

        ④包被溫度:2-8 ℃過夜包被或室溫(37℃)包被2h。

        ⑤包被濃度:包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

        3、封閉

        ①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)。

        ②選擇效果較好的封閉劑(細胞培養級BSA、Tween等)。

        4、加樣及孵育

        ①加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡。

        ②孵育的時間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件,建議加樣孵育時使用shaker震蕩儀,推薦軌道直徑3mm,轉速在500±50rpm。

        ③檢測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時間嚴格根據說明書提示。

        ④洗板對于ELISA來說,是極其關鍵的一步,保證ELISA的特異性。

        ⑤封板膜一定要一次一換,切勿二次甚至多次使用,以防交叉污染。

        5、顯色和終材暗總止

        ①使用前需檢查,底物在加入96孔板之前應為無色透明。

        ②顯色底物需現配現用,避免污染。

        ③孵育時間,說明書上為參考范圍,具體需要根據實驗條件自行摸索??蓞⒖紭饲鷿舛茸畲罂椎念伾?,變為藍色較明顯時即可。

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